Protocolo para cultivo de "allium cepa" (cebolla)

Especie: Allium cepa L. , cebolla

Vía de regeneración:
Organogénesis directa

Establecimiento de los cultivos:

a) a) Explante utilizado
§ § Bulbos procedentes de campo.
§ § Se corta el bulbo en 4 porciones y luego se eliminan las catáfilas más externas. Se siembra la porción basal (>1 cm) del bulbo conteniendo yemas axilares.
§ § Variedades empleadas: Valcatorce INTA, Refinta INTA.

b) b) Desinfección del explante
1. Dos lavado con H20 corriente con 0.04 % Tween.
2. Alcohol 70º durante 1 minuto
3- Desinfección con ClONa (lavandina comercial: 55,5 g.L-1) 30% 1 hora adicionado con 0.04% de Tween 20 en agitación.
4- En condiciones de acepsia, enjuagar tres veces con agua destilada estéril, 2 minutos cada uno.

c) c) Medio de cultivo para el establecimiento: (en tubos)

Macronutrientes de Murashige-Skoog (1962):
(NO3)2NH4 1.650 mg.L-1,
NO3K 1.900 mg.L-1
SO4Mg. 7H20 370 mg.L-1
PO4H2K 170 mg.L-1
SO4Fe. 7H20 27,85 mg.L-1
EDTA Na2. 37,3 mg.L-1

Otros:
PO4H2Na. H20 300 mg.L-1

Micronutrientes Murashige-Skoog (1962):
SO4Mn. 4H20 22,3 mg.L-1
SO4Zn. 4H20 8,6 mg.L1
BO3H3 6,2 mg.L-1
IK 0,83 mg.L-1
MoO4Na2.2H20 0,25 mg.L-1
SO4Cu. 5H20 0,025 mg.L-1
Cl2Co. 6H20 0,025 mg.L-1

Vitaminas de Morel (a la mitad) (1948):
Glicina 3,75 mg.L-1
Ácido nicotínico 0,625 mg.L-1
Pantotenato de Ca 0.125 mg.L-1
Piridoxina-ClH 0,125 mg.L-1
Tiamina-ClH 0,125 mg.L-1

Hormonas vegetales:
BAP 2 mg.L-1.
Otros:
, AAgar 7,5 g.L-1,
Sacarosa 30 g.L-1
pH= 5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

d) Duración del establecimiento: 30 días
e) Condiciones de incubación: 25 ºC + 1/20 + 1 ºC/20 ºC+1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.

Subcultivo: (en frascos)
a) a) Explante: yemas axilares
b) Medio de cultivo:
Idem medio de establecimiento adicionado con:
Hormonas vegetales:
BAP 2 mg.L-1
ANA 0,2 mg.L-1
Otros:
Agar 7,5 g.L-1
Sacarosa 30 g.L-1
pH= 5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

c) Condiciones de incubación: 25 ºC +1 ºC/20 ºC+ 1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.
d) Duración de esta etapa: 30 días
e) Tasa de multiplicación: 3 en 30 días por cada explanto (12/planta).

Alargamiento de las plántulas: (en frascos)
a) a) Medio de cultivo:
Idem medio establecimiento
Otros:
Agar 7,5 g.L -1
Sacarosa 40 g.L-1
pH= 5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.
b) Condiciones de incubación: 25 ºC + 1 ºC/20 ºC+ 1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.
c) Duración de esta etapa: 30 días

Bulbificación: (en frascos)
a) Medio de cultivo:
Idem medio establecimiento
Otros:
Agar 7,5 g.L-1
Sacarosa 80 g.L-1
pH= 5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.
b) Condiciones de incubación: 25 ºC + 1 ºC/20 ºC+ 1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.
c) Duración de esta etapa: 30 días

Aclimatación:
Se lleva a cabo en condiciones de invernáculo a 20- 25 ºC y 50 % humedad relativa.
Las plantas provenientes del cultivo in vitro son sumergidas en una solución de Captan 2 g.L-1 y Benomil 0,5 g.L-1. Con este procedimiento se elimina el agar de las raíces y a su vez se somete a las plantas a un tratamiento preventivo de fungicidas. Posteriormente, se llenan macetas con vermiculita o perlita estéril. Se separan las plantas en forma individual y se plantan. Durante los primeros 5 días las macetas se ubican debajo de un tunel plástico transparente con el objeto de mantener la humedad relativa cerca del 100%. Luego se va levantando el plástico gradualmente para lograr la aclimatación progresiva a la humedad relativa del ambiente
Luego de 4- 5 semanas las macetas se transfieren a condiciones a campo con tela media sombra por 1-2 semanas y luego al suelo definitivo.

Rendimiento de este protocolo:
En 90 a 120 días de cultivo in vitro se obtiene una tasa de multiplicación de 9-12 plantas/explanto y 36 a 48 plantas/bulbo.

Observaciones:
La aclimatación de la cebolla a condiciones ex vitro tiene un porcentaje de éxito del orden del 90-95%.

Bibliografía:
Kahane, R., Rancillac, M. and de la Serve, B.T. (1992). Long-term multiplication of onion (Allium cepa L.) by cyclic shoot regeneratrion in vitro. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture 28: 281-288.
Kahane, R., Teyssendier de la Serve and Rancillac, M. (1992). Bulbing in long-day onion (Allium cepa L.) cultured in vitro: comparison between sugar feeding and light induction. Annals of Botany 69:551-555.
Murashige, T. and F. Skoog (1962). "A revised medium for rapid growth and bio assay with tobacco tissue culture." Physiologia Plantarum 15: 473 - 497.


Otros protocolos en:
http://scholar.google.com.co/scholar?q=protocolos+para+cultivos+in+vitro&hl=es&um=1&ie=UTF-8&oi=scholart