viernes, 19 de septiembre de 2008

Protocolo para cultivo de "allium cepa" (cebolla)














Especie: Allium cepa L. , cebolla

Vía de regeneración:
Organogénesis directa

Establecimiento de los cultivos:

a) a) Explante utilizado
§ § Bulbos procedentes de campo.
§ § Se corta el bulbo en 4 porciones y luego se eliminan las catáfilas más externas. Se siembra la porción basal (>1 cm) del bulbo conteniendo yemas axilares.
§ § Variedades empleadas: Valcatorce INTA, Refinta INTA.

b) b) Desinfección del explante
1. Dos lavado con H20 corriente con 0.04 % Tween.
2. Alcohol 70º durante 1 minuto
3- Desinfección con ClONa (lavandina comercial: 55,5 g.L-1) 30% 1 hora adicionado con 0.04% de Tween 20 en agitación.
4- En condiciones de acepsia, enjuagar tres veces con agua destilada estéril, 2 minutos cada uno.

c) c) Medio de cultivo para el establecimiento: (en tubos)

Macronutrientes de Murashige-Skoog (1962):
(NO3)2NH4 1.650 mg.L-1,
NO3K 1.900 mg.L-1
SO4Mg. 7H20 370 mg.L-1
PO4H2K 170 mg.L-1
SO4Fe. 7H20 27,85 mg.L-1
EDTA Na2. 37,3 mg.L-1










Otros:
PO4H2Na. H20 300 mg.L-1

Micronutrientes Murashige-Skoog (1962):
SO4Mn. 4H20 22,3 mg.L-1
SO4Zn. 4H20 8,6 mg.L1
BO3H3 6,2 mg.L-1
IK 0,83 mg.L-1
MoO4Na2.2H20 0,25 mg.L-1
SO4Cu. 5H20 0,025 mg.L-1
Cl2Co. 6H20 0,025 mg.L-1

Vitaminas de Morel (a la mitad) (1948):
Glicina 3,75 mg.L-1
Ácido nicotínico 0,625 mg.L-1
Pantotenato de Ca 0.125 mg.L-1
Piridoxina-ClH 0,125 mg.L-1
Tiamina-ClH 0,125 mg.L-1

Hormonas vegetales:
BAP 2 mg.L-1.
Otros:
, AAgar 7,5 g.L-1,
Sacarosa 30 g.L-1
pH= 5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

d) Duración del establecimiento: 30 días
e) Condiciones de incubación: 25 ºC + 1/20 + 1 ºC/20 ºC+1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.

Subcultivo: (en frascos)
a) a) Explante: yemas axilares
b) Medio de cultivo:
Idem medio de establecimiento adicionado con:
Hormonas vegetales:
BAP 2 mg.L-1
ANA 0,2 mg.L-1
Otros:
Agar 7,5 g.L-1
Sacarosa 30 g.L-1
pH= 5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

c) Condiciones de incubación: 25 ºC +1 ºC/20 ºC+ 1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.
d) Duración de esta etapa: 30 días
e) Tasa de multiplicación: 3 en 30 días por cada explanto (12/planta).

Alargamiento de las plántulas: (en frascos)
a) a) Medio de cultivo:
Idem medio establecimiento
Otros:
Agar 7,5 g.L -1
Sacarosa 40 g.L-1
pH= 5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.
b) Condiciones de incubación: 25 ºC + 1 ºC/20 ºC+ 1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.
c) Duración de esta etapa: 30 días

Bulbificación: (en frascos)
a) Medio de cultivo:
Idem medio establecimiento
Otros:
Agar 7,5 g.L-1
Sacarosa 80 g.L-1
pH= 5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.
b) Condiciones de incubación: 25 ºC + 1 ºC/20 ºC+ 1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.
c) Duración de esta etapa: 30 días

Aclimatación:
Se lleva a cabo en condiciones de invernáculo a 20- 25 ºC y 50 % humedad relativa.
Las plantas provenientes del cultivo in vitro son sumergidas en una solución de Captan 2 g.L-1 y Benomil 0,5 g.L-1. Con este procedimiento se elimina el agar de las raíces y a su vez se somete a las plantas a un tratamiento preventivo de fungicidas. Posteriormente, se llenan macetas con vermiculita o perlita estéril. Se separan las plantas en forma individual y se plantan. Durante los primeros 5 días las macetas se ubican debajo de un tunel plástico transparente con el objeto de mantener la humedad relativa cerca del 100%. Luego se va levantando el plástico gradualmente para lograr la aclimatación progresiva a la humedad relativa del ambiente
Luego de 4- 5 semanas las macetas se transfieren a condiciones a campo con tela media sombra por 1-2 semanas y luego al suelo definitivo.

Rendimiento de este protocolo:
En 90 a 120 días de cultivo in vitro se obtiene una tasa de multiplicación de 9-12 plantas/explanto y 36 a 48 plantas/bulbo.

Observaciones:
La aclimatación de la cebolla a condiciones ex vitro tiene un porcentaje de éxito del orden del 90-95%.

Bibliografía:
Kahane, R., Rancillac, M. and de la Serve, B.T. (1992). Long-term multiplication of onion (Allium cepa L.) by cyclic shoot regeneratrion in vitro. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture 28: 281-288.
Kahane, R., Teyssendier de la Serve and Rancillac, M. (1992). Bulbing in long-day onion (Allium cepa L.) cultured in vitro: comparison between sugar feeding and light induction. Annals of Botany 69:551-555.
Murashige, T. and F. Skoog (1962). "A revised medium for rapid growth and bio assay with tobacco tissue culture." Physiologia Plantarum 15: 473 - 497.


Otros protocolos en:
http://scholar.google.com.co/scholar?q=protocolos+para+cultivos+in+vitro&hl=es&um=1&ie=UTF-8&oi=scholart

3 comentarios:

MARCO dijo...

hola mujer de lindos ojos,
la vida abeses se comporta de maneras caprichosas, insipientes y sobretodo acogedoras, que a partir de las pequeñas experiencias no muestran el gran significado de seguir vivos

DANIEL ALEXANDER PINZON dijo...

margara... bonito, se parece al mio. no sera copia.JAJAJAJAJAJA

EDUARDO MUÑOZ G. dijo...

Margarita: muy interesante tu blog, en la segunda entrada de tu blog debes justificarla, en el perfil te falta tu correo electrónico y tienes un error de ortografía. Espero que sigas creando más blogs y aprovechando las nuevas tecnologías.